代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)后新發(fā)展起來的全新的組學(xué)技術(shù)，其把人體當(dāng)做一個(gè)完整的系統(tǒng)，以高通量檢測(cè)終端代謝產(chǎn)物技術(shù)，并通過多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘，分析人體在不同生理和病理階段的代謝特征[1]。代謝組學(xué)這種“整體觀念”被認(rèn)為與中醫(yī)理論不謀而合[2]，因此，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)復(fù)方藥物研究，療效評(píng)價(jià)和中醫(yī)證候研究[3-5]。艾滋病(acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的以免疫缺陷為特征的傳染性疾病,目前尚無有效的疫苗預(yù)防，也無有效的藥物可以將其完全治愈。雖然AIDS在中醫(yī)領(lǐng)域是新發(fā)疾病，但治療已取得一定效果[6-7]，準(zhǔn)確的辨證分型是中醫(yī)治療疾病的關(guān)鍵，AIDS的中醫(yī)治療也不例外。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為研究中醫(yī)證候提供了新的思路。本研究擬選擇AIDS常見中醫(yī)證候脾腎虧虛的患者為研究對(duì)象，健康人作為對(duì)照，以超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performanceliquidchromatographycoupledtoquadrupoletimeofflightmassspectrometry，UPLC-QTOF/MS)技術(shù)測(cè)定其血清代謝物，使用多元分析方法分析艾滋病脾腎虧虛證代謝特征，為AIDS辨證分型提供參考。

　　資料與方法

　　1.研究對(duì)象2017年6月于河南AIDS高發(fā)區(qū)共納入37例研究對(duì)象。AIDS脾腎虧虛(AIDSPQ)組19例，其中男性10例，女性9例，平均年齡(48.32±5.85)歲;健康(JK)組18名，其中男性9名，女性9名，年齡(44.44±4.73)歲。兩組性別、年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。2.診斷標(biāo)準(zhǔn)艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2015年國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)推薦的《艾滋病診療指南》[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。脾腎虧虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2016年國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)和國家中醫(yī)藥管理局頒布的《艾滋病中醫(yī)(成人)診療方案》：主癥：面色少華，神疲乏力;次癥：納呆、便溏、或形寒肢冷，或腰酸、腰痛，或耳鳴，舌質(zhì)淡，苔白或滑，脈沉細(xì)或弱。健康人診斷標(biāo)準(zhǔn)：HIV抗體陰性，無明顯癥狀，身體健康無臟器嚴(yán)重疾病或慢性病急性發(fā)作者。3.納入標(biāo)準(zhǔn)AIDSPS組：符合艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合脾氣虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)(兩名副高及以上職稱中醫(yī)專家診斷一致)，年齡18～60歲，簽署知情同意書。JK組：符合健康人診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡18～60歲，簽署知情同意書。4.排除標(biāo)準(zhǔn)不符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)者，神志不清、癡呆、各種精神病患者，非感染艾滋病所患的臟器嚴(yán)重疾病者，原發(fā)性免疫缺陷者，激素化療等引起的繼發(fā)性免疫缺陷者，血液病者，其它原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，未簽署知情同意書者。5.試劑乙腈(色譜純級(jí)，購自MerckDarmstadt，Germany公司);甲酸(HPLC/SPECTRO級(jí)，購自MerckDarmstadt，Germany公司);甲醇(色譜純級(jí)，購自MerckDarmstadt，Germany公司)。6.儀器液質(zhì)聯(lián)用儀：美國WatersACQUITYTMI-ClassUPLC系統(tǒng)，XevoG2-XSQ/TOF質(zhì)譜儀，配有Lock-spray接口，電子霧離子源(ESI)，Masslynx4.1質(zhì)譜工作站;高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司;真空離心濃縮儀：英國GeneVac公司;電子天平：十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多集團(tuán));低溫冰箱：RevcoValueULT386-3-V42，ThermoScientific;超純水器：上海摩勒科學(xué)儀器有限公司。7.血樣采集與處理使用肝素鈉抗凝管收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象的清晨空腹時(shí)靜脈血5mL，13000r/min離心10min，取上清液于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩�檢測(cè)前，在室溫下解凍，解凍后取200µL，加甲醇600µL，渦旋振蕩30s，于4℃13000r/min高速離心10min，精密移取上清液440µL，采用真空離心濃縮儀濃縮至干;殘?jiān)��?00µL甲醇溶解，渦旋振蕩60s，于15000r/min高速離心10min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。8.液相色譜-質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱為AcquityUPLCHSST3C18(2.1mm×100mm，1.8µm);流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～9min，5%A;9～19min，40%A;19～25min，100%A;25～32min，5%A;流速：0.3mL/min;進(jìn)樣盤溫度：4℃;柱溫：4℃;進(jìn)樣量：3µL。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓：3kV，質(zhì)荷比范圍：50～1200，采用負(fù)離子掃描模式。離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度450℃，錐孔電壓40V，離子能量0.8V;錐孔氣流量為50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。9.數(shù)據(jù)分析檢測(cè)得到的得到所有樣品的總離子流圖，使用Water公司自帶的WatersProgenesisQI2.0sofware(NonlinearDynamics，Newcastle，U.K.)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括奇異點(diǎn)剔除、去噪、基線校準(zhǔn)、重疊峰分析、峰對(duì)齊、峰識(shí)別、峰特征提取、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等。所得質(zhì)譜矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)出到EZinfo3.0或SIMCA-P13.0(Umetrics，umeå，Sweden)進(jìn)行PCA和OPLS-DA等多元分析。通過構(gòu)建基于OPLS-DA模型，根據(jù)變量的重要變量因子(variableimportanceintheprojection，VIP)值挑選差異物，并對(duì)挑選出的變量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。差異物VIP>2，P<0.05和變化倍數(shù)>3或者<0.33確定為組間的差異代謝物。使用Water公司自帶的WatersProgenesisQI2.0software推測(cè)可能代謝物的物質(zhì)。

　　結(jié)果

　　1.PCA結(jié)果UPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)血清檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行預(yù)處理后，首先采用PCA方法對(duì)AIDSPS組和JK組血清樣本進(jìn)行多元分析，共得到有2個(gè)主成分的模型(R2=0.337，Q2=0.221)，得到的散點(diǎn)圖(圖1)顯示兩組可以得到區(qū)分，有明顯的差異性。2.OPLS-DA結(jié)果本研究的OPLS-DA模型，R2Y=0.972，Q2=0.950，表明模型有較好的解釋性和預(yù)測(cè)性。模型的方差分析結(jié)果顯示F=152.06，P<0.05，模型有效。OPLS-DA模型的得分圖見圖2A，結(jié)果顯示，此模型可以把AIDSPS組與JK組明顯區(qū)分。OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)(n=200)中左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值等于或小于0，則表明模型有效[9]。R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值<0，則表明模型有效，沒有過度擬合，見圖2B。3.差異代謝物篩選結(jié)果在OPLS-DA模型中VIP>2，變化倍數(shù)>3.00或者<0.33，并通過t檢驗(yàn)，P<0.05的變量確定為組間差異代謝物，共確定差異代謝物共11種，AIDSPQ組與JK組比較降低的是：磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ;升高的是：番茄素、牛磺膽酸、甘氨酸、甘氨膽汁酸、牛磺去氧膽酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物、膽紅素，結(jié)果詳見表1。

　　討論

　　中醫(yī)證候乃是疾病發(fā)生發(fā)展過程中生理病理的總結(jié)，是中醫(yī)了解疾病的關(guān)鍵所在。證候理論是中醫(yī)臨床治療疾病的總綱，證候分類方法則是中醫(yī)診治疾病進(jìn)行辨證的根基。然而，中醫(yī)證候理論和證候分類的物質(zhì)基礎(chǔ)近年來并未取得明顯進(jìn)展[10]，究其根本可能是仍然缺乏適宜的方法和途徑，獲得行業(yè)認(rèn)可的科學(xué)數(shù)據(jù)支撐中醫(yī)證候理論，從而使中醫(yī)證候理論保持良好的持續(xù)發(fā)展。代謝組學(xué)的發(fā)展為中醫(yī)證型研究提供了新的方法，代謝組學(xué)已經(jīng)越來越多的運(yùn)用于中醫(yī)證型研究領(lǐng)域并取得了一定的成果[11-12]。代謝組學(xué)技術(shù)在AIDS中醫(yī)證候領(lǐng)域也有應(yīng)用[13-14]。許前磊等[15-16]運(yùn)用氫核磁共振技術(shù)檢測(cè)出AIDS肺脾氣虛證患者與健康人尿液代謝差異代謝物為α-氨基丁酸、甲基丁二酸等物質(zhì);用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)出AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者與健康人血液代謝差異代謝物為酰基甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿。馬素娜等[17]運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)檢測(cè)出艾滋病肺脾氣虛證組和艾滋病氣陰兩虛證患者尿液潛在的4種差異代謝物。王娟等[18]利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將AIDS肺脾氣虛證患者和健康志愿者血液代謝輪廓得以明顯區(qū)別，并推斷出的9種可能的差異代謝物。本研究選擇AIDS脾腎虧虛證患者為研究對(duì)象，健康人作為對(duì)照，以UPLC-QTOF/MS技術(shù)測(cè)定其代謝產(chǎn)物，可以將兩組患者明顯區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)了11種代謝差異物，分別是磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ、番茄素、牛磺膽酸、甘氨酸、甘氨膽汁酸、牛磺去氧膽酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物、膽紅素。這些物質(zhì)主要涉及脂質(zhì)代謝，特別是膽汁酸代謝途徑;其次涉及氨基酸代謝途徑，如甘氨酸和前原卟啉Ⅸ。代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于脾腎虧虛證的研究尚未見報(bào)道，戰(zhàn)麗彬等[19]運(yùn)用UPLC-QTOF/MS技術(shù)檢測(cè)出脾氣虛證患者血漿中甘油磷酸膽堿和肉堿低于健康人，施旭光等[20]使用核磁共振氫譜在脾氣虛證患者和健康志愿者尿液中共篩選得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、牛磺酸及葡萄糖7種差異代謝產(chǎn)物;董飛俠等[21]發(fā)現(xiàn)腎陽虛患者與健康人尿液對(duì)照，代謝差異物為丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、檸檬酸、馬尿酸和組胺等物質(zhì)。代謝組學(xué)對(duì)相同或相近證型的研究結(jié)果都不盡相同，可能是由于證候判斷、檢測(cè)標(biāo)本或者檢測(cè)技術(shù)差異。運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)探索中醫(yī)證候的分型雖然取得一定的進(jìn)展，但由于代謝組學(xué)技術(shù)的靈敏性，其受到的影響因素很多，而且由于生物代謝的復(fù)雜性及中醫(yī)證候的多態(tài)性，其依然存在局限性。但不可否認(rèn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證候有廣闊的發(fā)展前景和潛力。

　　《艾滋病脾腎虧虛證血液代謝特征》來源：《中華中醫(yī)藥雜志》，作者：金艷濤 楊春玲 袁君 馬秀霞 武悅 許前磊 劉志斌